適用于激光熒光顯微鏡的光學濾光片

介紹

因為激光具有高亮度、穩定、長壽命及譜線窄等特性，它正逐漸取代了熒光成像應用中的傳統寬帶 光源。在成像應用中，激光的上述特性可提高可視化的靈敏度，也增加了光通量；激光更具有光束發散 角窄、高度的時空相干性、偏振特性明確等獨/有特性，從而催生了眾多新的熒光成像技術。然而，相對 于寬帶光源，當激光以熒光光源的形式出現時，為基于激光的成像系統（如共聚焦和全內反射熒光（TIRF） 顯微鏡）及其組件提出了新的限制要求。尤其是對光學濾光片有著更特殊的要求。

針對激光光源進行優化的光學濾光片

在過去四十多年里，已開發出了許多強大、高效且性價比好的激光器。人們通常按增益介質和激勵 方式對激光器進行分類。至今，受歡迎的用于熒光成像的激光器仍為氣體激光器（如氬離子和氪離子 激光器）常用的激光譜線為488、568和647nm。但在最近幾年，由于固態激光器的（電光轉換）效率明 顯更高（產生的熱量更低，實驗室安裝更加簡單）、尺寸更小，且成本更低，因此正在逐漸取代了體激 光器。比較流行的激光器類型包括半導體二極管激光器（尤其是405和635nm）、光泵浦半導體激光器（包 括廣泛使用的488nm），以及倍頻二極管泵浦固態（DPSS）激光器（包括561nm的黃光激光器和較新的515nm 和594nm激光器）。表1總結了在熒光成像應用中最/受歡迎的激光器。

激發濾光片：盡管尚有異議，但針對激光光源的消雜濾光片（激發濾光片）是十分重要的，可用它 阻擋不想要的非激光線波長的光，包括固態激光器中自發發射和氣體激光器的等離子線。這些濾光片不 僅要能夠濾掉的無用光（> OD 6），對于激光線也應具有高透過率（T>95%）（請參見圖1和3）。此外， 這些濾光片還要耐用，以承受高強度的激光束的照射。

與沿用了幾十年的傳統軟鍍膜的熒光濾光片不同，通過離子束濺射制作的新型硬鍍膜的薄膜濾光片 具有很高的激光損傷閾值（LDT）等級。Semrock 生產的的激光濾光片通常具有 1 焦耳/平方厘米或更高 的 LDT 等級，適用于強脈沖激光。對于連續（CW）激光器，該 LDT 等級相當于 10-100 千瓦/平方厘米。 此外，硬鍍膜濾光片幾乎不受溫度和濕度引起的環境退化的影響；由于具有高光學耐久性以及穩固的環 境可靠性，在大多數熒光顯微鏡應用中無需更換濾光片。

表1：常用熒光激光器

“DPSS”= 二極管泵浦固態激光器“OPS”= 光泵浦半導體激光器“倍頻”= 通過非線性光學晶體實現倍頻

用于激光器的激發濾光片還具有*的波長要求。有些激光器，如氣體激光器和DPSS激光器，具有非 常精確和窄的激光譜線。適用于特定激光譜線的理想激發濾光片為窄帶激光譜線濾光片（典型帶寬＜激光 波長的0.4%），關鍵在于激光譜線的精確定位。Semrock的MaxLine®激光譜線消雜濾光片是該應用的理想 選擇。但是，此類濾光片不適用于使用類似波長的多激光器的系統（如：激發GFP的473nm和488nm的激光 器，或將來可能升級到561nm DPSS激光的568nm氪離子激光器），也不適用于半導體激光器系統。

對于二極管和光泵浦半導體激光器來說，同一型號的激光器，因為溫度和使用年限的不同，每臺的光 譜輸出都會不同。因此，對于大多數此類激光顯微系統來說，采用與寬帶光源（如弧光燈）顯微系統類似 的寬帶激發濾光片是一個不錯的解決方案。例如，圖1所示的激發濾光片設計用于375nm和405nm的激光器， 而405nm激光器的長波邊緣需考慮±5nm的不確定性。但是，這些激發濾光片與寬帶光源濾光片并不*一 樣。濾光片除了精確定位相關激光器波長的邊緣位置，還需考慮其它重要因素，包括邊緣陡度和通帶紋波。 因為低紋波可確保特定激光譜線的高速傳輸，或隨著時間的推移，當半導體激光器的波長產生漂移時，陡 邊緣可提供很高的光學噪聲的區分。

圖1：測量典型的激光熒光濾光片組測得的光譜性能；

藍色線 - 激發濾光片；綠色線 - 分色濾光片；紅色線 - 發射濾光片

發射濾光片：可對所有可能用于此濾光片組的激光線，典型的Semrock發射濾光片都提供很高的阻擋 （> OD 6），因而確保了最暗的背景噪聲水平；同時，還能夠對發射信號提供很高的透過率（平均>97%）。 值得注意的是，并非所有寬帶光源的發射濾光片都能充分阻擋激光譜線，因此可能直接降低成像對比度。 與激發濾光片一樣，發射濾光片的邊緣波長應與相關激光譜線匹配，且短波邊緣的陡度也有嚴格要求。相 關的其它注意事項包括：應使用*光學質量的玻璃作為基質：自發熒光低，均勻性高，且楔角低，從而 最小化光束偏差（光束偏差會導致在更換濾光片時發生像素偏移）。

二向分光鏡：激光應用的分光鏡不僅要使其透過和反射的頻帶與激發發射濾光片匹配，而且還需防反 射涂層，從而盡可能地提高發射光的穿透率和消除相關干涉影響。Semrock激光分光鏡可保證s偏振光透過 率>98%和激光波長的平均偏振>94%，即93%以上的平均透過率和透過極寬通帶（900nm-1200nm）的超低紋 波。分光鏡還應具有類似于激發濾光片的LDT等級，且應在反射帶上具有較低紋波，從而盡可能減小激發 光強度的變化。

由于二向分光鏡直接暴露于強激發光線中，即使是來自濾光片的弱自發熒光，都會干擾發射光的信號。 因此，應采用超低自發熒光基質，如熔融石英。請注意，由于激發光和發射信號的強度相差多個數量級（通 常是106），對于發射濾光片，關于自體熒光的要求不會像對分色分光器的要求那么嚴格。盡管如此，在 TIRF顯微鏡中，發射濾光片的光強度級明顯高于典型的螢光廣角熒光顯微鏡中濾光片，因為TIRF系統中的 激光束會從樣本載玻片上*反射并沿發射路徑返回重新定向。因此，相比寬帶系統中的自體熒光，應更 仔細地考慮該激光系統中發射濾光片的自體熒光。

在某些應用中，二向分光鏡會對圖像質量產生顯著影響，尤其是在分光鏡平整度（曲率）不適合的情 況下更為明顯。即使透過波前差（TWE）受基質曲率的影響不太明顯，反射波前差（RWE）也會對成像質量 產生明顯影響。例如，當平整度不高的分光鏡置于激發光路[1]中，TIRF顯微鏡中的樣本照明可能會變弱。 同樣，由于硬涂層的固有彎曲應力，所以可能會導致從分色鏡[2]反射的成像光束產生像差。因此，某些 應用應采用平整度很高的分光鏡。對于大多數激光顯微鏡應用，分光鏡應足夠平，這樣照明的激光束的焦 點就不會發生明顯位移，其中焦點位移通常是由瑞利范圍[1，2]來定義的。簡單來講，經分光鏡反射的成 像光束（聚焦在探測器的陣列上，比如CCD）的合格標準是：經分光鏡上的反射作用后，受衍射影響的光 斑尺寸不應發生明顯變化。

多個光學濾光片組成的濾光片組：表2總結了用于激光系統的濾光片的關鍵特性。總的來說，濾光片最好 具有*的阻斷能力、對特定波長的光具有高透過率，同時不會影響受衍射限制的圖像質量。這些簡單的 要求不僅會影響各個濾光片的設計，而且還會影響該組合中使用的濾光片系統的設計。因此，激發濾光片 和發射濾光片的設計，以及二向分光鏡的設計應相互匹配，以獲得最高保真度的熒光可視化效果。

表2：激光成像系統用濾光片的關鍵特性總結。

例如，激發濾光片和發射濾光片的邊緣陡度是相互配合的。高邊緣陡度將對有限帶寬光的使用產生顯 著影響。因此，用于激光的濾光片組的激發片和發射片的分隔應該非常小。此分隔通常小于 Semrock 激光 濾光片組中最大激光波長的 1.5%.同時，激發片和發射片的交叉邊緣位置應具有足夠高的阻斷（> OD 6）， 以確保激發光不會泄漏到發射光的通道。

二向分光鏡和發射濾光片的組合性能還會對圖像配準產生影響。重要的是，應使用平整度*的玻璃 基質，以盡量減少基質的任何楔角（鍍膜前）以及鍍層應力導致的彎曲。用于熒光應用的濾光片采用全單 基帶通濾光片結構，因此制造基質時容易實現楔角的最小化（例如，激光發射片和分光鏡的楔角僅為幾弧 秒）。Semrock激光濾光片組自身就能提供出色的圖像配準性能：當相互交換這些濾光片組時，觀察不到 明顯的像素移位。通過激光濾光片組獲得的圖像不僅各熒光通道之間表現出極/好的圖像配準度，還能與非 熒光通道的圖像進行極/好配準（例如，微分干涉差成像（DIC）或其它明視場模式）。

對于單分子成像應用，激光也是非常適合的光源。這類應用要求十分嚴苛，如對發射光路混雜的激發 光要有非常嚴格的阻斷，同時最大限度地收集每一個從熒光基團發射的光子。在這種情況下，傳統的帶通 發射濾光片可被長波通濾光片代替（圖1). 長波通發射濾光片可從熒光基團捕獲最大信號，長波通濾光片 也可以極廣地分離了吸收和發射光譜。也有一些研究人員不使用發射片，只使用一片特定激光譜線的陷波 濾光片，因為此類濾光片能在激光器波長兩側提供最大透過率。在我們的觀察中，一些要求苛刻的應用（尤 其是TIRF系統）甚至可采用一個第二發射片或者采用一個陷波濾光片與各種激光濾光片組結合并達到較好 效果。采用第二濾光片（與第一發射片不相接觸）的主要目的是：確保高角度的散射激發光不會穿過整個 成像光路達到探測器[1]。

同時使用多個激光器

許多新的成像方法都基于安裝多個激光成像系統：兩色、三色，甚至四色系統都是非常常見的。

樣本采用多個熒光基團進行標記，這些熒光基團需在特定條件下才能清楚地看到。因此，就有必要合 并多個激光束（多重合并，或簡稱為 MUX）或分離某一復合激光束。相對于只用于成像的二向色鏡，用于 此類應用的二向分光鏡合并/分離具有*的要求。Semrock 的 LaserMUX™光束合成器（圖 2）提供高透過 率（透過率 R 大于 95％），以及對重要激光譜線的極優的反射性能（反射率 R 大于 98％），從而實現損 失的最小化。

圖2：合并激光束進行多色成像。

上圖：描述LaserMUX™二向分光鏡如何用于合并（多重合并）或分離（多路分離）激光束。

下圖：LaserMUX濾光片的典型測量光譜。

用于同時多激光成像的激發片和發射片以及二向分色鏡特別具有挑戰性。帶通濾光片必須具有多個傳 輸和阻斷帶（兩色、三色，甚至四色），同時需具有上述激光濾光片的各種特性，例如：非常適合激光譜 線的高傳輸和高阻斷，高邊緣陡度和精確對應正確的激光譜線。要求多邊緣的分光鏡能夠選擇性地從其發 射信號中分離出用于不同熒光基團的激發光。

由于有能力地生產多邊緣濾光片，且各邊緣都采用高陡度設計，因此可實現多個熒光基團的極/佳信噪 比，同時最大幅度消除熒光串色(Crosstalk)（圖 3).

圖4中顯示了可用于多種不同類型成像應用的多激光系統示例。突出顯示的是不同類型的光學濾光片。 在該示例中，結合了三個激光器，且該系統演示了通過退掃描和非退掃描探測路徑的共焦掃描，各路徑均 可實現同時多顏色探測。或者，如果沒有掃描功能，可與兼容TIRF的物鏡一起使用，進行TIRF成像。

圖3：Semrock四色激光濾光片組組適用于以下規格的激光器：375、405、473、488、491、559、 561、568、633、635和647納米的激光器；

藍線 - 激發濾光片，綠色 - 分色鏡，紅色 - 發射濾光片

結語

基于激光的顯微鏡成像系統結構復雜、價格昂貴，在從其中獲得最高性能的過程中，光學濾光片的作 用至關重要。正確的選擇使用與其性能匹配的光學濾光片更加重要。基于激光的成像系統的未來將會如 何？為了更好地觀察細胞或亞細胞相互作用機制，涌現了眾多的復雜的成像方案。例如，位于先進技術前 沿的超分辨率成像技術通常使用激光照明[3]。這些技術已經增進了成像的分辨率，達到遠低于傳統顯微 鏡的衍射極限（限制到幾百納米的分辨率）。

其他的幾種熒光成像技術，如 STED、PALM 和 STORM（在此不一一列舉），已證明了可以使用不同方法， 在觀察熒光標記樣本時達到幾十納米的分辨率。這些成像技術的前提是基于能準確定位單個熒光分子。由 于定位的精度隨著從給定熒光基團分子[4]獲得的光子數增加而顯著增加，高效的光學濾光片在這些前沿 應用中發揮了日益重要的作用。

圖4：復雜多激光器成像系統示例。特定激光濾光片為藍色突出顯示。